組織脂質過氧化氫（HYDROGEN PEROXIDE）含量比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

   組織脂質過氧化氫（HYDROGEN PEROXIDE）含量比色法定量檢測試劑盒是一種旨在通過過氧化氫與二價鐵離子的氧化反應，進而與顯色染料二甲酚橙結合，產生紫色復合產物所呈現的吸光峰值的變化，即采用比色法來測定組織裂解樣品中脂質過氧化氫含量的*而經典的技術方法。該技術經過精心改良芬頓（Fenton）反應、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體等）脂質過氧化氫的濃度檢測，以及抑制劑篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）是一種普遍存在的反應性毒性代謝副產物，通過線粒體呼吸鏈系統或氧化酶系統產生，受到過氧化酶（peroxidase）和過氧化氫酶（catalase）還原為水而去除。由于過氧化氫成為許多氧化應激狀態相關的關鍵調節因子，諸如NF-ΚB信號通路、氫過氧化介導通路等，因此過氧化氫的產生與哮喘、動脈硬化、糖尿病血管病、骨質疏松癥、神經性退行性病變和唐氏綜合癥等疾病關聯?；罨装Y細胞漿產生大量過氧化氫，而過氧化氫與鐵離子反應，導致脂質過氧化。過氧化氫的含量檢測，可以反映機體內的過氧化情況，同時反映機體內細胞活性、蛋白質糖基化、脂質氧化等，以及自由基損傷。脂質過氧化物，例如MDA，與過氧化氫水平之比，稱之為過氧化指數（peroxidation index），作為評價過氧化氫誘導脂質過氧化的標記。基于底物過氧化氫，在酸性條件下，與二價鐵（ferric）離子反應（Fenton 反應），氧化產生三價鐵離子（ferrous）和羥自由基，進而三價鐵離子與染料二甲酚橙（3,3'-Bis(N,N-di-(carboxymethyl)amino- methyl)-o-cresolsulfone-phthalein；xylenol orange）結合，形成穩定的紫色復合物，通過其吸收峰值的變化（560nm波長），來定量分析脂質過氧化氫的含量。其反應系統為：

產品內容

   清理液（Reagent A）  毫升

   裂解液（Reagent B）       毫升

   去干擾液（Reagent C）       微升

   反應液（Reagent D）  微升

   顯色液（Reagent E）       毫升

   陰性液（Reagent F）     毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存   去干擾液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在在4℃冰箱里；   反應液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；   顯色液（Reagent E）避免光照；試劑具有揮發性，注意密閉蓋子。有效保證6月

用戶自備

2毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品準備

• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升   清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（*速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個2毫升離心管
• 加入預冷的xx微升   裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存（注意：保存限于1至2月）或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長560nm，并置零 
• 從4℃冰箱里取出試劑，室溫下均衡；   顯色液（Reagent E）避免光照

• 背景對照測定

• 移取90微升上述制備的待測樣品到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升   去干擾液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒
• 在25℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx微升   陰性液（Reagent F）
• 加入xx微升   顯色液（Reagent E）
• 渦旋振蕩5秒
• 在25℃溫度下孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為12000g
• 移取上清液到新的比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品背景對照 

• 樣品測定

• 移取90微升上述制備的待測樣品到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升   去干擾液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒
• 在25℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx微升   反應液（Reagent D）
• 移取xx微升   顯色液（Reagent E）
• 渦旋振蕩5秒
• 在25℃溫度下孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為12000g
• 移取上清液到新的比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣本讀數

五、計算樣品濃度

注意事項

• 本產品為20次操作
• 本產品檢測范圍是1.微摩爾/升至1毫摩爾/升
• 操作時，須戴手套
•    反應液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 避免使用EDTA、山梨醇、亞鐵鹽（ferrous salt）、果糖、蔗糖、葡萄糖、甲酸、SDS、Tween 20、Tween 80、NP-40、Triton X100等處理樣品，否則干擾檢測
• 樣品須澄清，至關重要
• 如果用戶沒有匹配的濾波器，可以使用540至620nm波長的任一波長替代
• 測定值由低到高變化
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 待測樣品過氧化氫濃度大于1毫摩爾，必須進行稀釋，否則檢測讀數下降 
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 本公司提供系列過氧化氫檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感